尼康显微镜:德塞拿蒙偏置迟缓DIC显微镜

2019-06-12 18:53:33 28

在传统的微分干涉差显微镜DIC)的系统设计,偏置相位差引入到翻译的匹配(聚光镜和物镜)利用诺马斯基或改性Wollaston棱镜整个显微镜的光轴产生一个恒定的光程差的光学列车。也可以实现同样的效果可以通过一个固定的诺马斯基棱镜系统中的应用和四分之一波长的相位差板与偏振器或分析仪一起组成的一个简单的Sénarmont补偿。

de senarmont intro figure1

尼康Eclipse E600显微镜系列图1所示基本Sénarmont的配置为一体的现代化,直立研究工具。的偏振片和四分之一波长相位差板相结合,与主要的光端口中的显微镜底座上的固定螺丝固定到机壳。一旦固定到适当的位置,所述相位差板被保持在预先设定的取向,而偏振器可以旋转90度(加或减45度),绕光轴的显微镜。根据不同的方向相对于相位差板的偏振器,Sénarmont补偿照亮以线性,椭圆形,或圆偏振光显微镜的光学列车。

极化波前先退出的de Sénarmont补偿遇到固定诺马斯基的棱镜在显微镜聚光器转盘(见图1),其后重新导向,剪切产生振动方向正交分量(普通非凡的眼波)45度角的新兴从Sénarmont补偿偏振光。的聚光透镜系统聚焦成并行组件和项目到试样剪切的波阵面。收集离开标本的光由物镜聚焦到位于显微镜物镜转换器安置在一帧中的第二固定利用诺马斯基棱镜干涉平面。物镜利用诺马斯基棱镜,这是相匹配的聚光镜棱镜和反转,重新组合成同轴的正交分量的剪切的波阵面。虽然直线偏振光出射的光的物镜利用Nomarski棱镜被阻止由分析仪,椭圆形,圆偏振光可以通过组件通过以形成图像的标本。

微分干涉对比显微镜首次提出并设计了由弗朗西斯·史密斯于1955年,谁建立了一个修改后的偏光显微镜沃拉斯顿棱镜加入到前焦平面聚光镜和后焦平面的物镜。由于其设计上的局限性,沃拉斯顿棱镜随后更换了更先进的系统,介绍法国科学家乔治诺马斯基,使棱镜聚光镜和物镜孔径共轭平面一段距离的物理位置。这个改进允许标准显微镜的光学元件的使用在现代DIC系统,目前享有广泛的应用。

在相衬类似的方式中,是非常有用的可视化活细胞等透明,未染色的标本,否则难以观察到,在使用全孔径和分辨率的显微镜的光学系统的传统的明照明DIC的显微镜。然而,DIC不患晕文物蒙面孔相衬光学固有,并有能力生产出优秀的图像比较厚的标本。此外,DIC图像可以很容易地操作使用数码相机和录影成像技术,以进一步增强对比度。

de senarmont intro figure2

微分干涉对比效果通过转换梯度的函数在试样为振幅(强度,如在图2中示出)的光路长度的差异,可以在显微镜目镜(或记录在胶片上或数字)的对比度改善可视化。在试样的光路长度的主要决定因素是检体及其周围介质中,剪切的波阵面的光路上的两点之间经过的几何距离之间的折射率差。DIC的光学系统产生的图像有一个独特的阴影铸件的外观和显示伪三维,如果他们被照明从一个高度倾斜光源,从一个单一的方位角。一般,DIC是有用的,确定的方向相梯度利用充分物镜光圈产生薄的光学切片标本,没有超越眼前的焦平面定位的模糊干扰。

沃拉斯顿和诺马斯基棱镜

在微分干涉显微镜的关键要素进行匹配沃拉斯顿双折射和/或利用Nomarski棱镜,显微镜光学路径插入在一个45度角的偏振器和分析器(西北向东南)与剪切轴导向。渥拉斯顿棱镜的两个精密研磨和抛光的石英具有的光轴的垂直方向的楔形板的构造,上面的斜边胶合在一起,产生一个光学各向异性的复合板。事变线性极化波前进入一个的沃拉斯顿棱镜(面向在一个45度角棱镜光学轴)被分成两个独立的正交波,称为普通和特殊波。

因为它们是来自单个源的局部化区域(通常,钨卤素灯的灯丝),由渥拉斯顿棱镜产生的正交波阵面是一致的,具有相同的幅度,并在同一方向传播,通过下部的棱镜楔(参见图3(a))。普通波通过棱镜在垂直于光轴的方向上行进,而异常波的轴线平行地定向。此外,沿着这些垂直的轴不同的介电性能,产生一个行波通过棱镜在更高的速度比其他。普通波通过棱镜所得沿的快轴(具有低的折射率),并的异常波遍历速度较慢的轴线(较高的折射率)。

de senarmont intro figure3

胶结石英楔的折射率之间的交界处,发生的波阵面的角度分割或剪切,从而在空间上分开的剪切角定义为一个角度的波此外,波阵面棱镜楔边界交换身份,与普通波成为非凡波,反之亦然。整个棱镜的所有事件的波阵面的剪切角度和分离的距离是恒定的,而不管该表项的点,是指由棱镜剪切轴方向的波阵面的剪切此轴位于纵向平面的Wollaston棱镜,低级石英楔子的光轴平行的方向。在一般情况下,由渥拉斯顿棱镜(或利用Nomarski)产生的剪切距离小于千分尺,使没有可观察到的光束分离发生在从棱镜射出。

所经历的普通和特殊的波阵面的结果,在两个波的不同传播速度,因为他们穿过的渥拉斯顿棱镜的下部和上部部分的折射率差。在下半部分中的棱镜,波阵面进行完全补偿中的上半部分时,通过下和上半部的几何路径是相同的相移。然而,穿越点的波前相差的中心经验的下层或上层的棱镜,这会导致在剪切轴的方向的每单位长度的恒定相移的一半的旅程,通过较长的。相移是平等的,但相反,普通和特殊的波阵面。其结果是,在一端的棱镜,非凡的波阵面出现提前普通的波阵面,而在相应的位置上的另一端,普通的波阵面射出棱镜之前的非同寻常的波阵面。渥拉斯顿棱镜平面的焦点,或干扰,发生在棱镜的中心之间的光路的下部和上部的石英楔等于。出于这个原因,它往往是很难(或不可能),以适应标准的显微镜物镜,其中往往有一个埋内心深处的透镜的后侧焦点面(即必须在物理上与渥拉斯顿棱镜干涉平面重合),用于与一个Wollaston棱镜。

常规Wollaston棱镜类似,基本利用Nomarski棱镜的设计(图3(b))也包括两个石英楔胶合在一起为斜边的。上楔块常规渥拉斯顿石英楔子是相同的,但通过切割石英晶体产生的倾斜的光轴的方向上,相对于平坦面的棱镜下楔块被修改。,当楔块相结合形成的化合物的双折射棱镜的焦点(干扰)面在于在网站上的棱镜板外几毫米。产生这种情况的,因为剪切发生在石英棱镜楔形,而不是上面的接合边界在较低的空中接口,在渥拉斯顿棱镜。石英楔在利用Nomarski棱镜之间的界面的折射现象导致剪切的波阵面会聚以外的棱镜与一个交叉点(图3(b)中示出)。利用Nomarski棱镜焦平面的实际位置可以调整超过几个毫米的范围内,通过改变在较低的石英楔子用来构造棱镜的光轴的倾斜角度。

通常是构建现代DIC显微镜与诺马斯基棱镜,以避免物镜光圈间隙问题。事实上,修改后的棱镜通常采用两个光束在聚光镜中的占空比和物镜的焦平面剪切和重组。虽然有聚光棱镜,而这往往是精确定位的开口面内的空间的限制少,在大多数情况下,仍然使用利用Nomarski棱镜。利用Nomarski棱镜可以专为聚光镜,以产生一个干涉平面位于更接近于棱镜比用于与物镜构成。其结果是,除了被安装在具有不同的几何形状的帧,利用Nomarski棱镜发现在现代DIC显微镜往往是不同的切割是不可互换的。

Sénarmont DIC光学系统

传统的微分干涉显微镜的光学系统包含一个位于聚光镜前和分析器(第二偏振器)插入到上述物镜的途径,通常是在一个中间管或结合在该帧的我利用Nomarski棱镜的偏振器。偏振器的方向的振动面的透射轴定位的东 - 西,当分析仪相对于交叉的偏振器(透射轴是北 -​​ 南)。离开偏振器的线偏振光被分离成两个部分,利用Nomarski棱镜装在聚光镜附近的光圈光阑孔径的共轭焦平面。由棱镜入射的波前被剪切成正交偏振分量,由聚光光学系统的平行呈现,然后利用照射试样。

后面的位置的光学路径中的物镜是利用Nomarski棱镜的第二(通常是装在一个可调节的滑动框架),这是用来重组剪切后孔中的共聚焦面的波阵面后,他们已收集和集中由物镜。从重组的波阵面的圆形,椭圆偏振光通过组件通过分析器,随后进行干扰显微镜上面的中间图像平面生成DIC图像。

de senarmont intro figure4

在一个完全对齐的DIC显微镜,聚光棱镜成像通过聚光镜和物镜组件到物镜棱镜,在每一点上沿表面的棱镜,相对于彼此反转匹配,使波阵面的剪切。翻译两种棱镜沿剪切轴(垂直于显微镜的光学轴)产生的波阵面是均匀的跨显微镜孔径不匹配。相对于普通的波阵面的相位移的转移的非凡的波阵面通过棱镜的翻译通常被称为偏置相位差在DIC的显微镜的介绍由于利用Nomarski棱镜之一的是,横向移动(通常是物镜的棱镜),波前对背景变得越来越迟钝,彼此同相。因此,新兴从物镜诺马斯基的棱镜的光的极化向量方位可调节线性(无翻译),通过不同程度的椭圆形,甚至圆形。

DIC的光学系统偏置迟缓介绍产生变化的强度(振幅)在试样阶段梯度水平,从而导致产生的取向依赖性明亮的区域和较亮的背景上的阴影叠加。强度梯度沿剪切轴的聚光镜和物镜棱镜发生,一般出现源于一个45度角(西北向东南或反之亦然)当试样中的目镜观察。显微镜的光学轴在一个方向或另一个跨可移动棱镜将不同的正交波阵面之间的相位关系,在该样本中扭转阴影铸取向的。最终的结果是使标本图像伪三维浮雕地区增加光学路径长度(倾斜相梯度)显得更亮或更暗,表现出路径长度减小出现反向。

引入偏置相位差,这是越来越流行的一种替代技术,是四分之一波长的相位差板安装在固定的方向之间的偏振器和聚光镜棱镜(称为Sénarmont DIC补偿,如上文所讨论)。在最大的消光(匹配棱镜与没有施加偏压,请参阅图4(b)段),相位差板的快轴与偏振器的透射轴对齐,两个光学单元可以是(往往都是)内包含的的基础上,在显微镜上的同一外壳中。Sénarmont补偿器的备用位置,在显微镜配备适当的中间管(参见图1),之间的的物镜棱镜和分析仪。

为了使引入的偏置使用Sénarmont补偿器,偏振器的透射轴旋转(加或减45度,见图4(a)和图4(c))相对于相位差板的快轴,这保持固定到分析仪的透射轴相对于在一个90度的角。当补偿器的快轴相一致(平行)与偏振器的透射轴,只有直线偏振光通过通过Sénarmont补偿聚光棱镜,作为图4(b)中示出。但是,当偏振器的透射轴旋转时,从四分之一波长的相位差板的过程中出现的波阵面成为椭圆偏振光。旋转偏振器在一个方向上会产生右撇子的椭圆偏振光(图图4(a)),而在另一个方向上旋转偏振器将改变的矢量轨迹生成惯用左手的椭圆形扫描(如图4中所示(三))。

de senarmont intro figure5

当起偏器的透射轴的方向达到无论是加或减45度(相等于四分之一波长的相位差),补偿器的光通过圆偏振光(再次在任何一个惯用左手或右手的意义上)。因为椭圆或圆偏振光代表的普通和特殊的新兴的从Sénarmont补偿的波阵面之间的相位差,偏置引入到系统时的波阵面进入聚光镜利用Nomarski分光镜棱镜和剪切(图5)。正偏压时,得到的偏振片在一个方向上旋转,而通过在相反的方向旋转偏振器引入负偏压。引入由一个Sénarmont的补偿相位差的量可以定量,根据公式确定:

相位差(以纳米为单位)=θλ/180

其中θ是有关的相位差板的快轴的偏振器的透射轴的旋转角(以度计算),λ是平均波长的光通过补偿器。钨卤素灯照明的情况下,常常被认为是波长约为550纳米的计算涉及偏置相位差。使用Sénarmont补偿,偏压之间的二十分之一,全波长的相位差值可以很容易地测量,其精确度为0.15纳米。

偏置相位差的影响,DIC的光学系统引入由一个去Sénarmont的补偿器补偿器三个设置在图5中示出。在图5中示一个单一的波前进入Wollaston棱镜的中央部分的一个例子,但利用Nomarski棱镜会以同样的方式操作。当偏振器的透射轴平行排列的四分之一波长的相位差板的快轴(图4(b)和图5(b)),直线偏振光从补偿器,是下楔块表面聚光镜的入射渥拉斯顿棱镜(图5(b)所描述的)。在DIC的显微镜中,入射的线偏振光的方向以45度的角度下楔块组件的渥拉斯顿棱镜(或利用Nomarski)的快轴和慢轴。进入棱镜后,偏振光分离成正交分量,遍历低级石英楔子的快轴和慢轴,两个棱镜之间的楔形件的边界处剪切。因为线性的波阵面的单相形式存在,当它进入棱镜,最初的正交分量的相位时,它们在空气 - 石英边界,但在棱镜内经过相移。

如前所述,上楔块的渥拉斯顿棱镜的下部由普通的波阵面的相位的偏移量,增益后,普通和特殊波交换标识在两个楔块之间的交界处。最终的结果是一个取消的相位移位,产生在棱镜内的,正交的波阵面从沃拉斯顿棱镜彼此同相(图5(b))中出现。在这种条件下,光学系统具有最大的消光,目前只有大的相位梯度试样中是可见的。这些相位梯度被叠加在一个非常黑暗的背景上,或黑色,暗场图像的外观上。

偏振器是相差的零位置在去Sénarmont的补偿器在任一方向旋转时的情况是完全不同。新兴从补偿展览阶段的波前转移传授椭圆形或圆形的字符向量的正交波分量的总和。当偏振器是向左旋转30度(负偏压相位差;图图5(a)),生成由去Sénarmont补偿普通波前进入Wollaston棱镜的前非凡的波阵面,射出棱镜(交换身份后)非凡的波前提前普通眼波。的基本结果是产生的光程差,这是需要引入的偏置相位差。发生相反的效果(图图5(c))时,Sénarmont的偏振器是向右转动(正偏压相位差),从普通的波阵面的渥拉斯顿棱镜提前非凡的波阵面。

不管偏置是否被引入到翻译的物镜利用Nomarski棱镜或旋转的偏振片上解Sénarmont补偿由一个微分干涉对比系统,最终结果是相同的。在适当配置的显微镜正确对齐科勒照明,在光源和聚光棱镜的图像是由光学系统(聚光镜和物镜)转移到位于上面的物镜的后侧焦点面倒立的第二利用Nomarski棱镜。整个面部的聚光棱镜的线性相移被精确地补偿由一个相反的相移在物镜棱镜。翻译的物镜棱镜沿剪切方向不改变的相移分布,而是,添加或减去一个恒定的相位差在整个显微镜的光圈。旋转在去Sénarmont补偿偏振器中相同的方式,还引入了一个变量,并控制相位差。匹配的棱镜系统使图像形成发生与每一个波前对投影来自聚光镜的孔径相同的偏置电压的相位差,不论路由通过它穿过试样到达物镜。

de senarmont intro figure6

图6给出的是一系列的数字图像使用偏置在一些中间步骤中的二十分之一到四分之一波长的相位差范围内的记录,可在微分干涉对比。标本为5微米(厚度)制备人颊粘膜上皮细胞(脸颊)铺展在缓冲盐水溶液中的显微镜载玻片上,并通过一个170微米的玻璃盖成像。细胞表现出波动的厚度,其范围从约1至4微米的区域。的试样细节和阴影铸的伪三维效果是最显着的在较低的偏置相位差值(图6(a)和图6(b)),但细标本细节的对比度和清晰度都恶化,作为偏置相位差的移交增加(图图6(c)至6(f)条)。在偏置迟缓最高值(四分之一波长;图6(f)条),对比度极差,极少数的结构细节可见。对于这个特殊的试样,最佳相位差范围介于的二十分之一的波长的十二分之一。

由于标本中的光路梯度增加DIC的显微镜,所以图像的对比度。不同程度地改变偏置相位差也能产生显着的对比波动在试样中观察到的目镜(图6)。在一般情况下,诱导的翻译的物镜棱镜,或通过旋转在去Sénarmont补偿偏振器之间的普通和特殊的波阵面的位移,是最佳的程度上的顺序小于十分之一波长。但是,该值是在很大程度上依赖于试样的厚度,有用的范围的生物样本的偏置相位差之间的三十分之一和四分之一波长。对比标本中具有非常大的光学梯度往往可以受益于更大的偏置相位差值(全波长)。成一个微分干涉对比显微镜使偏置迟缓阶段更容易被观察的标本,并与传统的胶片或数码相机系统,极大地方便了成像努力。

Sénarmont DIC显微镜补偿迟缓板

通常所说的补偿相位差板领域的偏振光显微镜,补偿可以利用在DIC的显微镜操作量的对比从普通和非凡的波阵面之间的偏置迟缓。补偿板赋予更大的控制,用于调节有关的背景强度和颜色值中的试片细节的对比度,也使能更精确地调整偏置波阵面之间的相位差。这些双折射元件也经常采用的光学透明的标本的染色,通常呈现在有限范围内的灰度值。

开成一个微分干涉对比光学系统引入偏置与解Sénarmont补偿显微镜配备一个全波的相位差板可以被添加到光学与牛顿的干涉色和染色的标本,提供更定量的路径的差异(图7中所示的信息)。相位差板,可以被插入到一个Sénarmont物镜棱镜和分析仪或补偿器和聚光镜的棱镜之间的DIC显微镜的光学路径。许多显微镜在中间管或为此目的而设计的台下聚光器壳体有一个插槽。一阶补偿器(通常被称为一个全波一阶的红色的相位差板)具有等于全波长的可见光(约550纳米),绿色区域中的延迟值,除了引入了频谱的干涉色检体和背景(图7)。与补偿器代替,绿色光无法通过分析仪,因为它从与偏振器的电场矢量具有相同的方向的线偏振光的相位差板。然而,在红色和蓝色光谱区域的波阵面发生相位差小于一个波长,成为椭圆偏振光,使它们能够通过分析器传递组件。其结果是,这些颜色混合形成的视场中的品红色的背景。

de senarmont intro figure7

当试样被观察到在白光(钨卤素灯照明)与Sénarmont DIC的光学系统和一阶相位差板,背景出现洋红色,而图像的对比度,在将显示在二阶的蓝色和黄色的颜色的一阶(取决于取向)的牛顿的干涉色谱。插入光通路与相位差板,通过以下方式获得旋转在Sénarmont补偿偏振器的偏置相位差小的变化产生的快速变化,具有大的光学路径长度梯度的结构中观察到干涉色。这种技术是有用的颜色(光染色)引进具有高折射率的界限,如细胞膜,细胞内颗粒大,纤毛和细胞核的地区。标本功能显示的干涉色,一个的米歇尔征收颜色图表上的值进行比较,以获得的光程差的估计。

图7所示的是一些已通过两个标准偏置相位差技术和光学染色成像,并用一个形象的颜色显示的伪三维浮雕呈现半透明的标本。图7(a)示出了上面的偏置约十二分之一波长的相位差设置在栉鱼鳞横纹。进入显微镜的光学路径中插入一阶相位差板,会产生图7中所示的图像(b)中,呈现栉鳞二阶蓝色和品红色的背景上的黄色的干涉色的一阶。同样地,的籔枝螅水螅息肉由低中间偏置相位差值(图7(c))显示一个显着量的结构,而且还具有丰富的光谱的色彩与在光路中的相位差板(图7(四)) 。光染色,也可用于生产彩色反转阴影施放效果,在图7(e)和7(F)所示为透明粘稠部分小鼠肾脏组织。虽然图7中的图像不显示隐藏的科学信息有关的标本,他们这样做有可能提前DIC的光学显微镜技术,作为一个合法的科学和艺术之间的桥梁。

解读de Sénarmont DIC图片

通过观察在几乎每一个产生的图像通过偏置相位差引入由一个去Sénarmont的补偿阴影铸造定向本,光学剪切力的方向上是明显的,可以精确的轴连接区域显示的最高和最低的强度(振幅)的值定义为。检体相梯度(伪立体感的程度)的由Sénarmont DIC赋予的对比度水平旋转补偿器中的偏振器的光学系统引入的偏置相位差的量的函数。利用Nomarski棱镜设计由于剪切轴线是固定的,涉及的波阵面取向的DIC的显微镜的其他方面的限制,在轴方向不能改变,以影响通过一个简单的设置在显微镜标本的对比。然而,普通和非凡的波阵面之间的相对相位延迟是可以逆转的,旋转Sénarmont的补偿偏振片到相应的负值。当相位延迟被改变如刚才所述,在试样上的亮区和暗边的方向扭转180度。在本质上,可改变相对于试样的剪切轴的显微镜的唯一机制是调整试样本身,机动的方向,得益于利用循环360度可旋转的阶段。

SénarmontDIC的显微镜检查每个试样将有一个最佳的偏置补偿器,产生在最终图像中对比度最高水平的相位差设置。非常薄的试样显示一个浅的折射率梯度,如活细胞的培养,一般可使用同样低的偏置设置(小翻译偏振器)仅稍大于最大的相移标本中存在(约顺序的二十分之一波长,或约30纳米)。然而,较厚的标本往往需要较高的偏置设置(四分之一波长)大型聚光镜孔产生令人满意的结果,通常是通过光学切片。Sénarmont补偿最佳偏置延迟设置,因为许多试样组成的功能,显示的各种不同的尺寸和折射率,通常是一种妥协。

光学切片与de Sénarmont的DIC显微镜

图像标本Sénarmont DIC大型聚光镜和显微镜物镜的数值孔径的能力,使创造的光学部分聚焦的图像平面显着浅。如果不删除的焦点在侧面从明亮的区域的光晕和分散注意力的强度波动的干扰,该技术得到锐利的图像,都整齐地从复杂的三维相位标本切片。此属性通常利用取得清晰的轮廓,在复杂的组织细胞的光学部分的焦平面上的上方和下方的结构以最小的干扰。

在所有传统形式的透射和反射的光学显微镜,孔径光阑聚光镜发挥了重要作用,定义图像的对比度和分辨率。产生增强的对比度的同时,减小光圈的大小字段和整体图像的清晰度增加了深度。但是,如果聚光镜隔膜关闭太多,衍射工件变得清楚和分辨率牺牲。通常情况下,最佳的光圈设置是准确地渲染足够的对比度和保留图像分钟功能需要的分辨率,而避免衍射文物的标本细节之间的一种折衷。

de senarmont intro figure8

当聚光镜调整可变光阑到物镜后光圈大小的大约70%的,最高性能Sénarmont DIC光学系统产生优异的对比度。然而,这些显微镜也执行雄伟当打开聚光镜隔膜相匹配的物镜后孔直径。为了实现光学切片实验的分辨率和对比度之间的最佳平衡,这是关键是正确地配置在显微镜科勒照明,利用Nomarski棱镜组件,分析仪,Sénarmont补偿精确对准。

图8中所示的光学部分的的团藻起居室菌落使用de SénarmontDIC实现在一个倒置的组织培养显微镜的偏置相位差采取水生微生物组成的数百到数千相同的绿藻细胞具有大致相同的直径,但组织分为以下几种形态图案。的周边上的菌落,单个细胞被布置在一个半透明的广泛间隔层,称为粘液,如在图8中所示的(一)。到更远的质量,菌落形成几个集中的球形群体的生殖细胞,称为gonidia,从而产生小女儿在父殖民地的殖民地(图8(b))。由于本显微镜聚焦在最上层的菌落中的粘液(图图8(c)),结构的细节在各个细胞变为可见的,但被屏蔽许多细胞由子集落的。

生物薄试样(10至20微米厚)通常会产生贫困的光学部分在较低的放大倍率,但与高倍率物镜的数值孔径大(60倍和100倍)时,可视往往揭示大量的内部细节。较厚的标本可以随时切片在低倍率像差最小。收集从较厚的生物标本,特别是浸渍在水溶液中的生理盐水或缓冲溶液的光学部分,往往阻碍了玻璃盖和安装介质之间的界面处的折射率不连续性所产生的球面像差此神器将减少在光学部分系列的分辨率更高的穿透深度。

结论

在微分干涉显微镜的几何路径长度和试样的折射率变化,利用Nomarski棱镜安置在聚光镜中产生的两个正交的波阵面的相位差引入。最终的结果是,由物镜利用Nomarski棱镜和随后的图像形成复合,这些波作为一个组件穿过分析仪之间的波阵面的椭圆偏振。偏置相位差可以被引入到系统中翻译的物镜棱镜沿显微镜光轴或将一个四分之一波长板的偏振器或分析仪(补偿的Sénarmont)相结合。因此,通过简单的旋转控制旋钮,可以得到最佳的对比度,场亮度和灵敏度。使用的Sénarmont补偿DIC显微镜代替了传统的依靠翻译的物镜诺马斯基的棱镜的配置有几个优点,而这些好处是部分负责该技术的日益普及。

定量测定偏置迟缓应用于光学系统的确切数额难以确定,大多数聘请一个翻译诺马斯基的棱镜物镜后焦平面DIC显微镜。在某些情况下,利用Nomarski棱镜,具有高精度的千分尺控制转换设备的帧已被开发,这些组件可以被用来精确地测量的偏差量,介绍了以小的增量移动棱镜。然而,任何DIC显微镜可以配置为使用de Sénarmont补偿测量精确的偏置迟缓,仅仅通过增加一个刻度旋转偏光镜或分析仪和固定的四分之一波长相位差板的眼镜直通车。

偏置相位差进行定量测量的最方便的配置的一个示出由图1中的显微镜。该仪器包含一个位于两者之间,在物镜转换器,利用Nomarski棱镜观察管在主框架上的中间管。中间管插入到一个标准的550纳米的Sénarmont补偿器(最初设计用于偏振光测量)安置在偏振器的快轴平行的固定框架(东 - 西)和分析仪的慢轴平行(朝南)。以上的de Sénarmont补偿是一个360度调节的帧含有一个线性偏振元件(作为分析仪),毕业于单度。游标尺的线性偏振器的透射轴的方向,能够准确地测定,并提供控制的能力(表压)的电平的偏置相位差的波长的几级分的显微镜常伴有圆形的控制旋钮。,当DIC显微镜最初翻译的物镜诺马斯基的棱镜设计介绍偏置迟缓,被配置为刚才所描述的,准确的测定偏置迟缓是可能的。然而,在这些条件下,重要的是进行初始配置匹配棱晶(物镜和聚光镜)前插入Sénarmont的补偿器和旋转分析仪的干涉条纹的最大程度的重叠(最大消光)。

SénarmontDIC补偿的另一个重要优点是这些组件的重要的图像形成和光圈值的共轭平面中的显微镜的光学列车接近。与滑动的物镜利用Nomarski棱镜设计的显微镜必须物理翻译化合物棱镜元件的光学路径,而对面的显微镜观察到的水平应用到系统中的偏置相位差。在许多情况下,特别是如果棱镜框架松散适合在山上,严肃的形象转变可能发生在棱镜翻译,阻碍标本观察能力和捕捉图像。图像移位不能发生过程中引入的偏置相位差与一个去Sénarmont DIC显微镜,主要是因为在补偿相位差板和旋转偏振器被定位在聚光镜前或后的物镜,在显微镜的照明通路,和不内的图像形成的光学元件。这种差异应该是选择定量DIC实验显微镜配置时要考虑的一个重要因素。

比较传统和Sénarmont DIC显微镜配置时,符合人体工程学的考虑也很重要。现代显微镜的设计阶段和重点定位在前面显微镜基地,桌面高度,和近在咫尺操作的控制旋钮。这些特性允许更宽松的姿势与双手在桌面上舒适地休息,以帮助消除疲劳,减轻压力的可能性,这最终会导致神经肌肉疾病。在传统的DIC显微镜,操作者必须不断提高手(臂)以上的水平的物镜,以便调整利用Nomarski棱镜的位置。然而,在符合人体工程学Sénarmont设计中,补偿器组件被放置在显微镜的基础上的前端的照明端口,非常接近下降的聚焦旋钮和阶段平移控制杆。DIC显微镜的所有显微镜控制机制上接近,大大降低了操作者的疲劳,在长时间的连续观测。

增强视频显微技术,利用精确的偏置介绍由de Sénarmont补偿的相位差值。经常提到的缩写,VE-DIC(微分干涉对比视频增强),该技术是能够记录标本精细结构的细节,那就是超越的复合式显微镜的光学分辨率。视频增强DIC显微镜一直是一个强有力的研究工具,在细胞生物学个人微管的组装动力学测量和可视化细菌鞭毛的运动,这两者都没有解决使用其他技术。如上所讨论的,非常薄的DIC样品的大多数是最好的观察偏置的平均相位差值的波长的二十分之一。然而,当视频增强DIC图像分辨率标本(如微管和微型的细胞器),偏置的相位差值下降约百分之一的波长必须采用。显然,这些非常轻微的水平低下是最好的实现具有高精确度,刻度和游标装备,旋转偏振器(仪)组件设计与de Sénarmont的补偿。

中为首的微分干涉显微镜的成像优势,不管偏置相位差引入的机制,通过这种机制,是(与暗场或相衬)更小的试样的功能的图像没有被遮盖住的毗邻区域具有大的光学路径梯度。此外,中性灰色的背景上显示的图像的阴影铸造,耦合到一起与那些更大的(例如,分钟附加物活细胞或动态的夹杂物和移动的细胞器,细胞内的非常小的特征成像的灵敏度) ,传统对比度增强技术是一个显着的改进。这些好处,除了对比度控制宽动态范围和浅景深,都促成了该技术的广泛普及。



客服热线

工作时间9:00-17:00
021-51602084
电话咨询
邮件咨询
在线咨询
QQ客服