徕卡显微镜，超高分辨率显微镜提供了新的洞察核孔复合体组织
在核孔复合体（NPC）是一个大的蛋白质复合物在核膜，占本门的真核基因构成。这种复杂的包含数百蛋白质的形成为注定要进入或离开细胞核化合物的选择性门。
正因为如此出色的功能的全国人大结构的极大兴趣。到目前为止，全国人大结构分析已主要限于结晶研究或电子显微镜（EM）。单个组件的一些结构已经被破译了晶体。然而，组织的复杂内部个别蛋白质的仍然遥遥无期。其中的差距已经被关闭通过使用*高分辨率显微镜。
一月Ellenberg和他的团队的科学家在EMBL在海德堡获得新的见解全国人大结构的帮助下基态损耗（GSD）显微镜。
什么是GSDIM方法为您的研究的优势是什么？
在我们的研究中，我们试图了解大型多蛋白复合物，如核孔复合体（NPC），都是建立。因为它们的尺寸和复杂性，例如分子机器是*出了单个方法的范围和素来结构生物学的一个挑战。原子分辨率的方法，例如X-射线晶体学或NMR需要纯化样品和不适合于非常大的程序集。虽然，电子显微镜允许的大复合体在其天然环境中的细胞的观察，它往往是很困难的分配的电子密度以单个蛋白。在荧光显微镜中的蛋白质的身份是已知的，*分辨率（SR）现在让我们来可视化低于衍射极限的细节。当SR被结合的颗粒平均，蛋白质的位置可以被映射到亚纳米精度的规模，使得光镜适用于大型复合物的结构研究。因此，SR显微镜可以连接不同类型的数据，并*终帮助生成的多蛋白装配伪原子模型。此外，特别是GSDIM和其他本地化SR方法的一大优点是，他们是相对简单的使用，并定期让蛋白质在10〜20 nm的间隔的分辨率。这对我们来说是重要的，因为我们可以获取大数据集，并期待在一个相对有效的方式很多不同的标记。
什么是新的见解它给你的问候核孔复合体的结构？你去过哪些细节能够可视化的*次？
Nucleoporins是建立核孔（见图1）的蛋白质。*次，SR显微镜使人们有可能解决的几个这些蛋白质的组织周围的怪物。平均数千这些环允许我们测量相对于具有亚纳米精度的孔的中心不同nucleoporins的位置。然后，我们可以比较系统地构成了所谓Nup107-160亚复合，这是NPC*大的建筑块和孔结构支架的主要组成部分nucleoporins的径向位置。
图1 ：一个U2OS细胞标记的抗nucleoporin Nup133和缀合的Alexa Fluor 647的第二抗体抗体的核的底面。沿着传输轴线观察个体的NPC如环状结构可见。比例尺：3微米。
如何将我们的核孔复合体的认识现在要修改？
在我们*近的研究中，我们提供了Nup107-160亚复合的成员的位置约束，并根据这些数据，我们能够解决一个长期存在的争议中的字段：这个亚复合的取向的问题相对于所述传输轴。这是理解如何全国人大的结构支架的组织又迈进了一步。我们希望在未来，我们将能够映射毛孔的所有蛋白质并提供这一重要运输机械的综合结构模型。
请描述你刚刚开发相结合的成千上万的*分辨率显微镜图像达到低于一纳米精度的方法。
虽然SR显微镜使我们能够想象周围的人大中心nucleoporins的组织，这些图像的原始分辨率将不足以直接看到相同的亚复合个别蛋白质之间的微小差异。因此，我们开发了一种分析方法，其染色的特异性标记个别的NPC的许多图像在空间仔细对齐的孔的中心，或者在标记的第二信道的参考蛋白质的位置，然后被相加，以产生的平均图像（见图2）。由于我们使用数千结构相同的图像，该注册过程是非常精确的。我们然后能够通过用适当的数学模型拟合平均信号，以确定荧光标记物的位置。重要的是，我们发现，这种平均过程的精确度取决于在一定程度上的原始数据的质量。为了使我们的测量不同的蛋白质和实验之间*可媲美并移除劣质染色潜力的文物，我们实现了一个自动化的流水线分析控制参数，如定位精度和密度。关于生产的统计学显著数据，我们可以在从GSDIM方法和一种有效的漂移补偿（为SuMo）阶段的可靠性和鲁棒性另外的好处。
图。2：例平均过程的结果。（一）一个NPC的形象标记对Nup96抗体（高斯滤波）。（二）NPC的平均图像用针对Nup96抗体通过比对了8000图像各个孔和求和产生。（三）围绕人大中心对Nup96荧光标记物，从平均图像的轮廓确定的平均位置。比例尺：0.1微米。
总而言之，我们的方法是通用的，可以测定相对于对称结构或参考蛋白质具有亚纳米精度和准确度的中心的荧光标记物的位置。应用该方法的核孔的几个不同的蛋白质，我们可以相对于所述结构的中心分配它们的相对位置。这个信息使我们能够确定在NPC脚手架单亚复合的方向（参见图3）。
图3 ：应用平均化过程在Nup107-160亚复合（由不同颜色描绘）的几个表位，它们的相对位置可以被确定。染色是通过使用GFP融合蛋白的纳米抗体的标签来实现。位置信息被覆盖与NPC的细胞质环的电磁结构。电子密度图的礼貌澳Medalia教授。
什么是必须克服的制备*分辨率样本的一般障碍？您使用了这项研究有哪些标记？
虽然工作在这个项目上，我们意识到，获得尽可能*好的荧光标记是在一个SR实验中*关键的步骤之一，*分辨率方法一般需求更高质量的样品比传统的显微镜。虽然几个方面的样品制备，如低背景和良好结构的保存，是很重要的，这两个*重要的限制因素，在我们的例子中是标记试剂的大小，并且可以实现标签的密度。*初我们用间接免疫荧光法用抗nucleoporin抗体，这使得内源性蛋白在细胞特异性标记。但是，使用的抗体的一个主要限制是它们的大小-它们可能从目标表位达15nm的偏移荧光团。此外，我们的平均方法需要高密度的标签样本。这是*可以实现具有非常高亲和力的抗体，我们只能够获得这样的试剂，我们有兴趣。我们通过表达nucleoporins如GFP融合蛋白和染色样品与小荧光解决这两个问题的nucleoporins的一个子集标记的抗-GFP的纳米抗体，这是一个常规的IgG只有十分之一的大小，从而减少潜在的*过一半的偏移。重要的是，因为这个标签是由基因编码它使我们能够在一个简单的和可比的方式标注几个nucleoporins。为了达到*大的标记密度，我们通过RNA干扰耗尽内源性未标记的蛋白质。
你看到了使用新的GSD 3D技术在您的研究领域是什么可能性？
像所有的大蛋白复合物，人大是一个三维结构，以了解它是如何建成的*分子组装的各个部分的高解析度3D视图将是必要的。尽管我们近期的研究提供了新的见解NPC支架的组织，我们只能确定一个方向nucleoporins的位置 - 沿孔隙的半径。在3D进行这种测量将更加翔实。
此外，我们相信，*高分辨率显微镜将成为不只是核孔，还包括其他大型集会的蛋白质结构研究的重要工具。这种简化我们的分析 - 然而，在NPC的情况下，我们的事实，对核的底部几百毛孔都可见相同的方向帮助。这种择优取向未找到许多其他有趣的多蛋白装配的，而这种复合物的*分辨率结构的研究只可能具有3D成像。