徕卡显微镜 - 活细胞双色动态超高分辨率成像之STED标记方法

2019-09-12 16:07:21 825
奥林巴斯显微镜


随着技术的发展,在超高分辨率显微成像技术的使用上,科学家已经不满足于只观察固定细胞或组织的亚细胞器超微结构,活细胞超微结构的动态超高分辨率追踪由于可以提供常规显微镜下无法观察到的更接近自然状态的微观变化,日益成为研究人员竞相涉足的领域。


STED (Stimulated emission depletion, 受激发射损耗) 超高分辨率成像是纯光学意义上的超高分辨率技术,成像过程只需打开 STED 激光而无需后期计算,就可以快速得到超高分辨率图像。因此在活细胞动态超高分辨成像方面,相比其他的超高分辨率技术,STED 存在先天的优势。


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▲ 图 1. 多色超高分辨率显微成像:3 个 STED通道 + 1 个共聚焦通道。

STED:Alexa 647-波形蛋白 (红色)、Alexa 594 -α 微管蛋白 (绿色)、Alexa 488-微丝 (青绿色)。共聚焦:DAPI-DNA (蓝色)。致谢:Eugene Katrukha,荷兰乌特勒支大学



有机染料的开发

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众所周知,超高分辨率成像技术 (包括 STED) 都需要将目标结构标记上荧光比较强且光稳定性好的染料,特别是活细胞超高分辨率成像就更是如此。传统的活细胞成像方法主要是通过在细胞中转染荧光蛋白而实现。相比之下,有机染料比荧光蛋白更有优势,因为它们能产生比荧光蛋白高几个数量级的光子,从而在成像时能达到更好的分辨率。但是,能和 STED 成像匹配的活细胞有机染料并不多,因为大多数的有机染料都不能透过细胞膜和活细胞内的结构特异性结合。    


SiR 染料 (硅罗丹明) 的发现使 STED 活细胞成像向前推进了一大步。这种染料可轻松穿透细胞膜进入细胞,并且荧光亮度和稳定性都非常好。SiR的化学结构和光谱性能如图2,激发峰在 650 nm, 使用 775 nm 波长作为损耗光即可做 STED 成像。因为具备近红外染料的特性,SiR染色可以在更低的损耗激光能量之下得到更好的分辨率。目前,市场上已经有商品化的 SiR-Tubulin 和 SiR-actin, 直接加入活细胞中,就可以实时采集到细胞内微丝和微管的超高分辨率图像。

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▲ 图 2. SiR的化学结构和光谱



双色超高分辨率成像标记

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这样仅是较好的解决了单色活细胞 STED 成像的问题。如果需要跟踪活细胞内多种组分的变化及其相互作用就需要面临多色标记的困难。SNAP-TAG 和 HALO-TAG 的方法很好的解决了这个问题。


SNAP-TAG 是一种经过改造后的DNA修复酶,可以特异性和它的底物BG (benzyl guanine苄基鸟嘌呤) 结合,如果将这种DNA修复酶的基因和目标蛋白的基因融合并转到细胞内,那么在细胞内加入标记了荧光的底物就可以看到细胞内目标蛋白的荧光。HALO-TAG也是类似的原理,只不过HALO-TAG的底物是CA (chloroalkane 氯烷烃)。

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▲ 图 3. SNAP-TAG示意图

研究者们通过这种标记工具SNAP-TAG -SiR和HALO-TAG-ATTO590分别标记活细胞中的线粒体和内质网,并使用超高分辨显微镜(STED)观察了这两种细胞器中不同蛋白的相互关系和动态变化(如下图4),2秒/张的频率拍摄100张图片后,荧光亮度仍然保持不变。可以观察到线粒体和内质网融合的整个过程,如视频1和视频2。

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▲ 图 4. STED纳米显微镜下内质网与线粒体的相互关系


 

▲ 视频 1. COS7活细胞线粒体和内质网成像,Scale bar = 2 µm


 

视频 2. 内质网小管收缩可能形成线粒体的动态过程,Scale bar = 500 nm


优势

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首先,SNAP-TAG -SiR和HALO-TAG-ATTO590双色活细胞标记系统亮度高、光稳定性好,容易透过细胞膜在不影响细胞正常生理状态的前提下进行SiR和ATTO590双色标记;其次,这两个染料可以用相同的损耗激光采集STED图像,大大加快了图像的采集速度,能够完全满足多色、快速、活细胞动态超高分辨率成像的要求。


近几年来,随着STED技术的发展,科学工作者也不断开发出可以用于STED活细胞成像的染料和荧光蛋白,相信在不久的将来会有更多的活细胞STED标记工具供研究者选择,并达到更高的分辨率,得到超越前人的实验结果,实现STED成像领域的更大突破。


参考文献:

Francesca B., Emil B. K., Edward S. A., et al. Two-colour live-cell nanoscale imaging of intracellular targets. Nat. Commun. 7: 10778 (2016).

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