利用金属镀膜可视化DNA分子

2019-09-10 14:19:46 admin 242

重金属(如铂)的精准小角度旋转投影可用于透射电子显微镜(TEM)成像,以观察先前被吸附在细小颗粒度、电子束可穿透的碳薄膜上的样本分子细节。  


为了得到最高的对比度和更好的成像质量,镀膜必须是方向性的,而且需要和样品有一个精准的角度。此外,覆盖样品表面的金属层颗粒精细度和镀膜材料的厚度均一性,也是获得高质量TEM图像的关键要求。

奥林巴斯显微镜

今天小编给大家介绍的是电子束蒸发在DNA分子可视化中的应用。本文中的实验方法最初由José Sogo博士在苏黎世ETH研究所实验室获得,改进后由Massimo Lopes教授在苏黎世大学IMCR研究所得以推广[1]。由于该方法在2018年又进行了优化[1],因此,给大家简要介绍其最新关键步骤,以及生物科学家如何使用徕卡EM ACE600高真空镀膜仪获得高质量实验结果

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图1. 徕卡高真空镀膜仪EM ACE600


小角度旋转投影

徕卡新一代EM ACE600(图1)可产生均匀、非常薄且颗粒度小的电子可穿透性碳层,因此可用于吸附生物样本(如DNA分子、蛋白质或DNA-蛋白质复合物)。然后使用精确且可再现的投影角度将单个分子或吸覆在碳膜上的大分子复合物投影,从而产生高对比度TEM图像。

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图2. 科学家和EM ACE600



实验中的关键步骤、DNA样品的准备

该方法适用于已经纯化好的、不含蛋白质和RNA分子的DNA样品,可以基于DNA链的不同厚度来区分双链DNA(dsDNA)和单链DNA(ssDNA)。

 第一步  DNA分子在甲酰胺,乙二醛和去垢剂苄基-二甲基-烷基-氯化铵(BAC)中形成稳定溶液。这种混合物通过特定的扩散方式散布在水表面上,DNA分子形成单分子层膜。

 第二步  用400目TEM铜网接触水面上的DNA单分子层膜,在该铜网表面形成均匀、低颗粒度的薄层(4-8nm)。然后将其立即浸入乙醇和乙酸双氧铀溶液中。

 第三步  对吸覆DNA分子的铜网进行精准的小角度旋转投影,镀铂8nm。这种负染对于dsDNA链的可视化特别有效。

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图3. EM ACE600高真空样品仓和倾斜式双镀膜靶源



如何利用EM ACE600制备高质量的碳膜层?

高质量的碳膜和精确的小角度旋转铂金投影的结合才能产生高质量的DNA链的TEM图像。使用EM ACE600高真空镀膜仪在V2高级云母片上产生碳膜,然后将其漂浮在水的表面上,最后在上面放置400目铜裸网,无额外的方华膜和支撑材料,这种方法产生的碳膜高效吸收DNA分子,并且不需要辉光放电(glow discharge)。


如何利用EM ACE600进行小角度旋转投影的镀铂?

400目铜网表面吸附的DNA分子,需要进行精准的小角度旋转投影。借助ACE600,8 nm铂膜制备将十分简单,只需将铜网固定在EM ACE600的GRID台子上(图3),运行EM ACE600两个不同的程序即可。


 1  在碳网表面上喷镀0.4 nm的铂金层,此过程镀膜夹角为1°且不旋转GRID台子;


 2  同样以1°夹角镀膜7.6 nm的铂层,但将GRID台子的旋转速度设定为1级。


结果优化须知

将蒸发参数(主要是蒸发速度)设定为在恒定值(0.03-0.08 nm/s)以保持合适的蒸发速度,对于形成理想碳膜厚度和小角度旋转投影非常重要。为了得到高质量的细颗粒金属层,电子枪和蒸发室必须保持极其清洁。

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图4. EM ACE600触控屏交互方式



新一代高真空镀膜仪优点

与上一代MED蒸发镀膜仪相比,新一代徕卡EM ACE600高真空镀膜仪具有众多优点


镀膜仪采用优化的设计和坚固的硬件,使其具有良好的操作性和结果稳定性电子枪的改进和新式电子控制系统可以让用户在触控屏上查看、设置所有参数。此外,EM ACE600还具有安全警报功能,如果张力和电流超过一定值,则不会产生电子蒸发,这有助于用户的安全操作和设备的自我保护,获得可靠结果同时延长设备使用寿命。


DNA分子(宽度约2.2-2.4 nm)的可视化,要求非常精准且可再现的投影角度,因此对镀膜仪的要求很高!


新一代徕卡EM ACE600采用参数可视化和精准控制的交互方式(图4),允许用户无需具备深厚相关工作经验和大量预实验,甚至可以直接调用其他用户已保存的单个或整个操作参数,即可完成意想不到的实验结果!



结果

使用BAC、醋酸铀染色和EM ACE600制备的小角度旋转投影可视化溶液中质粒DNA分子的TEM图像(图5)。这些图像表明,该方法可以有效可视化、区分ssDNA和dsDNA。

比例尺(大约相当于1 kb DNA长度)。红色箭头表示质粒复制区域。dsDNA厚度约为20 Å (1 Å = 1x10-10 m= 0.1 nm)。在该实验条件下,0.36 nm大致对应于1 bp的dsDNA。该结果使用某品牌透射电子显微镜,在80 KV下成像。

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图5a. 使用EM ACE600镀膜仪可视化溶液中质粒DNA分子的TEM图像。成像条件如上述


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图5b. 使用EM ACE600镀膜仪可视化溶液中质粒DNA分子的TEM图像。成像条件如上述


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图5c.含复制叉的DNA TEM照片,DNA提取自芽殖酵母S.cerevisiae。

比例尺(大约相当于1 kb DNA长度),成像条件如上述


参考文献

[1] Zellweger R., Lopes M..  Dynamic Architecture of Eukaryotic DNA Replication Forks In Vivo, Visualized by Electron Microscopy. Methods Mol Biol. 2018;1672:261-294. doi: 10.1007/978-1-4939-7306-4_19

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043630


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标签: DNA分子
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